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平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(PRM) :

PRM是一種基于高分辨、高精度質(zhì)譜的離子監(jiān)視技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段(如發(fā)生翻譯后修飾的肽段)進(jìn)行選擇性檢測，從而實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行定量。PRM技術(shù)基于Q-Orbitrap為代表的高分辨、高精度質(zhì)譜平臺，首先

利用四級桿質(zhì)量分析器的選擇能力，用Q1選擇目標(biāo)肽段的母離子,隨后在Collision cell中對母離子進(jìn)行碎裂，后利用Orbitrap分析器在二級質(zhì)譜中檢測所選擇的母離子窗口內(nèi)的所有碎片信息。這樣即可對復(fù)雜樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行準(zhǔn)確地特異性分析。

實驗意義:

PRM技術(shù)是針對無抗體蛋白的驗證新技術(shù)，用于label free, iTRAQ, TMT, SILAC等相對定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的驗證，或?qū)?fù)雜樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行靶向定量分析。

實驗步驟:

用PRM進(jìn)行蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)驗證的一般步驟為:

結(jié)果展示

實驗完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn):

1.實驗周期: --般PRM時間為: 5-10天

2.交付標(biāo)準(zhǔn):

組學(xué)驗證:

①主要儀器、試劑和實驗方法。

②PRM目標(biāo)離子信息:肽段序列和定量子離子。

③方法學(xué)重復(fù)性評價:三次技術(shù)重復(fù)的色譜峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) (預(yù)實驗結(jié)果) 。

④實驗結(jié)果:二級圖譜，XIC圖譜,原始峰面積強(qiáng)度值，矯正后的相對表達(dá)量，兩組樣本間的相對比值，ttest p值。

相對/定量:

①主要儀器、試劑和實驗方法。

②PRM目標(biāo)離子信息:肽段序列和定量子離子。

③方法學(xué)評價:相對定量的重復(fù)性評價-測試樣本的三次技術(shù)重復(fù)的色譜峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) (預(yù)實驗結(jié)果) ;

定量的方法學(xué)評價-標(biāo)準(zhǔn)品XIC圖譜，LOD， LOQ,線性范圍， 6個稀釋梯度得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性公式(每個稀釋度有3次技術(shù)重復(fù))。

④實驗結(jié)果:

相對定量:二級圖譜，XIC圖譜,原始峰面積強(qiáng)度值，矯正后的相對表達(dá)量，兩組樣本間的相對比值，ttest p值。

定量:二級圖譜，XIC圖譜,原始峰面積強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的蛋白質(zhì)濃度值，兩組樣本間的相對比值，ttest p值。

需確認(rèn)的信息:

1.樣品:

①如果樣品為蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)總量≥300mg;

②如果是組織樣品，樣品總量≥0.1g;如果是細(xì)胞樣品，細(xì)胞數(shù)量≥107個;

③如果是體液樣品，血清≥200ml，腦脊液≥200ml, 尿液≥1ml,淚液≥1ml。

2.樣品采集過程中使用到塑料制品時，盡量使用無色進(jìn)口產(chǎn)品，以減少塑料制品中雜質(zhì)對質(zhì)譜檢測的影響。

文獻(xiàn)參考

[1] Navin Rauniyar. Parallel Reaction Monitoring: A Targeted Experiment Performed Using High Resolution and HighMass Accuracy Mass Spectrometry. IntJ Mol Sci. 2015 Dec; 16(12): 28566- -28581.

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